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小麦收购过程中呕吐毒素检测方法的探讨

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呕吐毒素主体成分为DON(脱氧雪腐镰刀菌烯醇),属于单端孢霉烯族化合物,主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌产生。由于她可以引起猪的呕吐,故又称呕吐毒素。研究表面,DON化学性能非常稳定,一般不会在加工、储存以及烹调过程中破坏,121℃高压加热25min仅有少量破坏,烘培温度210℃,油煎温度140℃或煮沸,只能破坏50%。含有呕吐毒素谷物类加工产品,在加工过程中,由于技术限制不可能完全去除,人食用含有一定量的呕吐毒素粮油食品后,会出现胃部不适、眩晕、腹胀、头痛、恶心、呕吐,手足发麻、全身乏力、颜面潮红、以及食物中毒性白细胞缺乏症。呕吐毒素主要通过胃肠道吸收,经血液循环进入肝脏代谢后经肾脏随尿液排出,造成各器官的广泛损伤。它在人体中的半衰期为2-4h,代谢迅速,8h后就检测不到呕吐毒素和它的代谢物。

呕吐毒素可在人和动物体内蓄积,具有致畸性、神经毒性、胚胎毒性和免疫抑制作用。呕吐毒素的产物菌株适宜在阴凉、潮湿的条件下生长,广泛存在于大麦、小麦、玉米和燕麦中。

我国《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中规定,小麦粉、小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇限量标准为1000μg/kg。

由于呕吐毒素对人体具有较大的伤害,近年来相关部门加大了对市场中面粉等食品的呕吐毒素含量检测,在检测中一些面粉加工企业的部分批次产品被检出呕吐毒素含量超标,相关产品面粉加工企业只能回收处理,给企业造成较大的损失。而面粉中的呕吐毒素主要来自于小麦,且在面粉加工过程中,对呕吐毒素没有有效的去除方法,只能通过控制小麦中的呕吐毒素含量来保证面粉中的呕吐毒素含量不超标。因此面粉加工企业纷纷加强了对采购小麦的呕吐毒素含量控制。

目前对呕吐毒素国内常用的检测方法主要有以下几种:高效液相色谱法、酶联免疫检测试剂盒、胶体金免疫层析法、荧光定量免疫层析法。


高效液相色谱法

►  主要试剂与仪器

高效液相色谱仪;天平;粉碎机;移液器;免疫亲和柱;甲醇;聚乙二醇。


►  呕吐毒素标准品溶液的配制

临用前将高浓度呕吐毒素标准品,用流动相逐步稀释配制成适当浓度的标准溶液。


►  提取净化

准确称取25g均匀样本于250ml规格三角烧瓶中,加5g聚乙二醇,加入125ml去离子水,于往复式振荡器剧烈震荡20min。用快速滤纸过滤,收集滤液于15ml离心管中;再将滤液经微纤维素滤纸过滤,收集滤液于新离心管中作为上清液。取2.5ml上清液以1-2滴/s的速率将其通过免疫亲和柱,直至空气吹出柱内的全部液体,再用10ml去离子水以1-2滴/s的速率洗涤亲和柱,直至空气吹出柱内的全部液体。最后用2ml甲醇以1滴/s的流速淋洗亲和柱,收集滤液于玻璃试管中,在50-60℃加热条件下氮气吹干,然后用流动相复溶。用高效液相色谱进行测定,根据峰保留时间定性,根据峰面积外标法定量。


  实际操作过程的优缺点

高效液相色谱法优缺点

酶联免疫检测试剂盒

  主要试剂与仪器

酶标仪、恒温培养箱、移液器、呕吐毒素酶联免疫检测试剂盒


  测定步骤

●    根据样本检测数插入相应数量的酶标板微孔于反应板支架上,标记好标准品孔和样品孔,然后加入200μL左右稀释好的洗涤液,放置1min,倒掉液体后拍干。

●    在标准品孔中加入50μL各浓度的标准品,在样品孔中加入50μL样品液。每孔都加入50μL稀释后的DON抗体溶液,混合摇匀,在37℃恒温箱中孵育60min。

●    孵育结束后甩掉微孔中的液体,然后每孔加入250μL稀释后的洗涤液,放置1min倒掉液体,倒掉液体后用力拍干。每孔分别加入100μL稀释后的酶标二抗溶液,在37℃恒温箱中孵育30min。

●    孵育结束后甩掉微孔中的液体,然后每孔加入250μL稀释后的洗涤液,放置1min倒掉液体,倒掉液体后用力拍干。每孔分别加入50μL显色剂和50μL反应底物,轻轻摇匀,在37℃恒温箱中显色反应15min。

●    显色反应结束后每孔加入50μL终止液,用酶标仪在450nm处进行测定(必须在加入终止液后10min内完成测定)

●    用酶标仪在450nm处测定的标准品孔的光吸收值以及对应浓度绘制标准曲线,通过标准曲线,定量样本中呕吐毒素含量。


  实际操作过程的优缺点

酶联免疫检测试剂盒优缺点

胶体金免疫层析法

  主要试剂与仪器

粉碎机、离心机、电子天平、呕吐毒素胶体金检测卡、纯净水、样本稀释液


  样本前处理

●    称取0.5g有代表性的粉碎后的样品,加入4ml纯净水提取。

●    用力震荡5min,离心机4000RPM离心2min。


  检测步骤

●    用吸管吸取0.6ml上清液到小烧杯中,吹干滤液,然后用0.3ml体积稀释液复溶杯底固体。

●    取出试纸,用滴管向试纸孔缓慢而准确地逐滴加入3滴检测液。

●    根据试纸上C、T线的显色情况来判断呕吐毒素含量是否高于检测限。


  实际操作过程的优缺点

胶体金免疫层析法优缺点

荧光定量免疫层析法


  主要试剂与仪器

真菌毒素荧光定量快速检测箱(内含恒温孵育器、快速检测仪等)、呕吐毒素荧光定量快速检测卡、呕吐毒素样品稀释液、纯净水


  样本前处理

●    称取5g有代表性的粉碎后的样品,加入25ml纯净水提取。

●    涡旋振荡器振荡5min,离心机4000rpm离心2min。

●    取100μl上清液加入到1000μl样品稀释液中配成待测液,混匀备用。


  检测步骤

●    将孵育器、检测仪开机,设定相关参数,并插入本批次产品ID卡。

●    取出检测卡,水平放置于恒温孵育器上。

●    用移液器吸取100μl待测液,加入到检测卡的加样孔中,计时8min孵育。

●    8min后将检测卡插入荧光定量快速检测仪中,按读数键读数。

●    定量检测结果将呈现在快速检测仪的显示屏上,可准确知晓呕吐毒素含量。


  实际操作过程的优缺点

荧光定量免疫层析法yqd


关于微测 

南京微测生物科技有限公司是一家致力于食品安全与动物疾病领域快速检测技术和产品开发的国家级高新技术企业。自主开发的荧光定量FPOCT快速检测技术平台,具有灵敏度高、定量范围宽、准确度高、稳定性强、操作快速简便等优点,正逐步替代胶体金试纸条和酶免试剂盒等传统快速检测产品,引领国内食品安全和动物疾病快速检测从粗略定性到准确定量的升级换代。

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