摘要：对南京微测生物科技有限公司研发生产的呕吐毒素荧光定量检测试纸条在粮食谷物饲料中的检测性能进行了评估。该产品的检出限为25μg/kg，最低定量限为82μg/kg，线性范围为100-5000μg/kg，线性范围内的添加回收率为83.51%~113.84%，同一个样本的检测3次的CV<14.75%，与其他真菌毒素的交叉反应率均小于5%，与其代谢物的交叉反应率在20%以内。该产品具有操作简便、灵敏准确、快速定量、重现性好等优点，适合用于对粮食谷物饲料中呕吐毒素的进行快速定量测定。

　　关键词：呕吐毒素快速定量检测;荧光定量免疫层析;呕吐毒素;粮食谷物饲料

　　呕吐毒素主体成分为DON(deoxynivalenol,脱氧雪腐镰刀菌烯醇)，属于单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌产生。另外，头孢菌属、漆班菌属、木霉属等菌株都可产生该毒素。单端孢霉烯族毒素共有150多种，是一类强有力免疫抑制剂，所引起典型症状是采食量降低，所以这类毒素又叫饲料拒食毒素。呕吐毒素(DON)是其中最重要一种毒素，主要来自镰刀菌属(Fusarium)，尤其是禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)和黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)。由于它可以引起猪的呕吐，故又名呕吐毒素(vomitoxin，VT)。

　　该毒素最早于1970年在日本香川县的一次赤霉病大麦中毒的病毒中发现，1972年，由日本的Morooka等首次从赤霉病大麦中分离，Yoshizawa等阐明了这种新的真菌毒素的结构，并将其命名为4-deoxynivalenol(DON)。1973年Vesonder等在美国从被镰刀菌污染的玉米中分离出了同样的化学物质，因为该种物质可以引起猪产生呕吐症状，故命名为呕吐毒素，并相继发现可以在赤霉病大麦、被镰刀菌污染的玉米中分离出该物质。呕吐毒素是食品中常见的真菌毒素，在自然界中广泛存在，通常在欧洲及北美发现的3种毒素是脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇。由于它们具有很高的细胞毒素及免疫抑制性质，因此，对人类及动物的健康构成了威胁，特别是对免疫功能具有明显的影响。根据DON的剂量和暴露时间不同可引起免疫抑制或免疫刺激。当人摄入了被DON污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。由于中国传统饮食习惯中粮谷比例大大高于西方，使得呕吐毒素的危害更为突出。1998年，在国际癌症研究机构公布的评价报告中，呕吐毒素被列为3类致癌物。欧盟要求呕吐毒素要小于1.0mg/kg;中国谷物饲料中要求呕吐毒素的含量低于低于1 .0mg/kg，饲料中低于5 mg/kg。

　　目前，国标法测定呕吐毒素需要大型的仪器设备，价格昂贵，操作过程复杂、时间较长，且无法在现场和基础小型实验室使用。除此之外，也有采用呕吐毒素酶联免疫试剂盒或胶体金快速检测试纸条用于大量样品的筛查，操作简便，检测快速，成本也较低，但准确性和重复性较差，容易造成假阳性或者假阴性。因此，急需一种既简便快速，又能准确定量的检测方法，荧光定量免疫层析正好可以满足这种需求。本文通过对多种粮食谷物饲料样品的实测，验证了南京微测生物开发的呕吐毒素荧光定量快速检测试纸条的技术性能。

　　1实验材料和方法

　　1.1试剂和材料

　　除注明外，均为分析纯，试验用水均为UP水。

　　荧光荧光定量检测试纸条(由包被有荧光微球标记呕吐毒素抗体的乳胶垫、喷涂有呕吐毒素抗原的检测线和喷涂有羊抗鸡二抗的控制线的NC膜、样品垫及吸收垫组成)、样品提取液、样品稀释液、标准曲线ID卡及标准曲线条形码均由南京微测生物科技有限公司提供。

　　呕吐毒素及其他真菌毒素的标准品：购自Sigma公司;

　　大米、玉米、小麦、面粉等样品从超市购得或从企业取样。

　　麸皮，小麦、面粉等饲料样品从饲料厂和企业取样。

　　1.2仪器与设备

　　FD-100型荧光免疫定量分析仪和FD-5000型试纸条恒温孵育器，南京微测生物科技有限公司提供;低速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司;漩涡振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司;电子天平：Sartorius;

　　1.3试验方法

　　1.3.1样品的前处理

　　取具有代表性的待测样品500g，用小型粉碎机粉碎1min后过20目筛，收集过筛的细小样品。称取1.0±0.02g过筛的样品于10mL离心管中，加入5mL提取液，用漩涡混匀仪震荡5min(或者摇床振荡10min)后，4000RPM离心1min，取上清。

　　1.3.2检测过程

　　取50μL离心上清液加入500μL样品稀释液中，用漩涡混匀器混匀3-5s，然后取100μL加入到呕吐毒素荧光定量检测试纸条的加样孔中，置于37℃恒温孵育器中温育10min后，将试纸条插入荧光免疫定量分析仪中读数，即为样品的实际检测浓度。当检测值大于5000μg/kg时，可用提取液将离心上清液稀释5倍后再进行检测，所得读数值乘以对应的稀释倍数即为最终的检验结果。

　　2检测结果分析

　　2.1线性范围与检出限

　　取7个无污染(阴性)小麦样品和7个无污染(阴性)玉米样品，分别添加100μg/kg、250μg/kg、500μg/kg、1000μg/kg、2500μg/kg、5000μg/kg 的呕吐毒素标准品，用上海飞测生物呕吐毒素荧光定量检测试纸条每个样品检测3次，以添加浓度为为纵坐标，以荧光定量检测试纸条的检测结果为横坐标，拟合曲线并计算线性相关系数，结果如下：

　　图1 小麦中呕吐毒素标准品添加与荧光定量试纸条检测值的线性关系

　　图2 玉米中呕吐毒素标准品添加与荧光定量试纸条检测值的线性关系

　　计算得出小麦的线性范围：100～5000μg/kg(6点)， 回归方程: y = 0.981x + 60.52，相关系数R² = 0.997;玉米的线性范围：100～5000μg/kg(6点)， 回归方程: y = 0.976x + 52.00，相关系数R² = 0.998;(见图1和图2)。

　　取10个无污染(阴性)小麦样品和10个无污染(阴性)玉米样品，用上海飞测生物呕吐毒素荧光定量检测试纸条每个样品检测3次，检测限(LOD)为测定平均值加3倍标准偏差，定量限(LOQ)为测定平均值加10倍标准偏差。测试结果表明，DON的LOD为25μg/kg，LOQ为82μg/kg。

　　2.2准确性和重复性分析

　　在用国标法测定为0的空白样品中分别添加呕吐毒素总量为100，250，500，1000，2000，5000μg/kg，然后按照呕吐毒素荧光定量检测试纸条的检测方法进行检测。检测结果见表1。

表1  不同样本检测的准确性和重复性

　　从表1可以看出，南京微测生物科技有限公司所生产的呕吐毒素荧光定量检测试纸条测试不同粮食谷物中呕吐毒素的添加回收率在83.51%~113.84%，3次重复的变异系数在14.75%以内。

　　2.3与色谱方法的对比试验结果

　　大米、小麦、玉米、面粉、麸皮、喷浆玉米、大豆、豆粕各1份共24个样本，先采用国标液相色谱法进行测定，再使用上海飞测生物科技有限公司所生产的呕吐毒素荧光定量检测试纸条进行测定，各测试3个平行样。检测结果如下：

表2  与液相色谱法结果比对（μg/kg）

表2表明，在不同的粮食谷物饲料中，南京微测生物科技有限公司所生产的呕吐毒素荧光定量检测试纸条与液相色谱法的符合率为102.00%~110.85%，3次重复测定的的CV值在8.84%以内。

      2.4方法特异性

选择 DON结构类似物和其他5种真菌毒素的标准品在阴性玉米中进行添加，添加的浓度为1000 μg/kg，然后用飞测生物呕吐毒素荧光定量检测试纸条进行测试，每个样品测3次取平均值；结果显示与赭曲霉毒素A，伏马菌素B1，黄曲霉毒素B1、T-2毒素、玉米赤霉烯酮交叉反应率均＜5%，与其代谢物、结构类似物有一定的交叉反应（＜20%）。实验结果表明，呕吐毒素胶体金试剂条对伏马毒素、赭曲霉毒素、黄曲霉毒素、玉米赤霉毒素几乎无交叉反应，其方法特异性可以能满足检测要求。

表3 交叉反应率表

　　3结论

　　本实验采用南京微测生物科技有限公司所生产的呕吐毒素荧光定量检测试纸条对不同的粮食谷物饲料样本进行测试，该产品的检出限为25μg/kg，最低定量限为82μg/kg，线性范围为100-5000μg/kg，线性范围内的添加回收率为83.51%~113.84%，同一个样本的检测3个样本的CV<14.75%，与其他真菌毒素的交叉反应率均小于5%，与其代谢物的交叉反应率在20%以内。其准确性和可靠性均可以满足欧盟和我国对呕吐毒素的分析标准的技术要求。该方法具有简便快速、准确可靠、重复性好等特点，可用于不同粮食谷物饲料中呕吐毒素的快速定量检测分析。